Analýzy> Mikroskopická (bakterioskopická) studie gramově znečištěného nátěru v diagnostice infekčních a zánětlivých procesů

Informace jsou zveřejněny pouze na stránkách. Nezapomeňte konzultovat s odborníkem.
Pokud v popisu najdete chybu v textu, nesprávnou zpětnou vazbu nebo nesprávné informace, informujte o tom správce webu.

Recenze na tomto webu jsou osobní názory osob, které je napsali. Nepoužívejte samoléčebné léky!

Smrtí na flóru žen: co to určuje, rychlost a patologii

Smear on flora - často jmenován gynekologickou analýzou. Co ukazuje a jaké mylné představy existují na jeho účtu?

Tato analýza může být nazvána "obecná". Jedná se o primární diagnózu, která dovoluje doktorovi potvrdit nebo popřít přítomnost zánětlivého procesu v pochvě, uretře, cervikálním kanálu a také vyvodit jisté závěry o možných menopauzových nebo klimakterických změnách u pacienta.

• mikroskopický (bakterioskopický) Gramově zafarbený nátěr je oficiální název;
• skvrna od genitálií;
• bakterioskopie;
• mikroskopie.

Používá se k diagnostice infekčních a zánětlivých procesů. Bakterioskopie umožňuje detekovat bakterie ženských pohlavních orgánů: nejjednodušší mikroorganismy - gonokoky, provokující kapavky, trichomony - příčinu trichomoniázy. Také odborník v mikroskopu uvidí některé bakterie, houby (Candida), klíčové buňky (známka bakteriální vaginózy). Typ mikroorganismu je určen jeho tvarem, velikostí a také zda je barvena barvivem nebo nikoliv, to znamená, že je gram-pozitivní nebo gram-negativní.

Kromě toho v rozmezí od každého bodu (odebraného z pochvy, uretry, cervikálního kanálu) se počítá počet leukocytů v zorném poli. Čím více z nich - tím výraznější je zánětlivý proces. Odhadované množství epitelu a hlenu. Plochý epitel je zvláště bohatý u žen v reprodukčním věku během období ovulace - uprostřed menstruačního cyklu.

• vaginální kandidóza (drozd);
• bakteriální vaginóza (dříve nazývaná gardnerellóza);
• gonorea;
• trichomoniasis.

Pokud neexistují žádné zřejmé známky jedné z těchto onemocnění, ale rozmazání je špatné, provádí se hloubková studie o materiálu - provádí se spodní voda.

Důvody pro provádění očkování v gynekologii

1. Pokud je v nálevu středně velké nebo velké množství leukocytů, ale příčinný účinek infekce není znám. Vzhledem k mikroskopii existuje nižší limit detekce mikroorganismů: 10 až 4 - 10 až 5 stupňů.
2. Pokud je zjištěn mikrob, je třeba zjistit jeho citlivost na antibiotika.
3. Pokud se objeví známky infekce houbami. Přesné určení typu hub a předepisování účinného antimykotika.

Jiné druhy hub Candida nelze léčit, pokud nejsou patologické příznaky.

Pokud se objeví klíčové buňky (příznaky bakteriální vaginózy), jsou přítomny i jiné mikroby. Pro identifikaci.

Jaké jsou rozdíly mezi spodní vodou, rozmazanou flórou a stupněm čistoty vagíny?

Ve výzkumné metodě. Při obecném nátěru je materiál nanesený na skleněný díl obarven speciálním barvivem a prohlížen pod mikroskopem. A když se provádí bakteriologický (bakalářský, kulturní, mikrobiologický) výzkum, je nejprve "oset" na živném médiu. A pak po několika dnech se podívají pod mikroskop - které kolonie mikroorganismů rostou.

To znamená, že pokud mluvíme o expresní analýze, dostanete názor pouze o počtu leukocytů, epitelu a hlenu. Výsev není nutný

Rovněž s mikroskopií můžete rychle určit stupeň čistoty z pochvy. Zde lékař hodnotí pouze vztah mezi normální, podmíněně patogenní a patogenní mikroflórou.

Klasické hodnocení čistoty vagíny.

Co lékaři nevidí mikroskopicky

1. Těhotenství K určení, není třeba rozmazání a bez ohledu na to, jaký výsledek to ukáže. Musíte projít krevní test na hCG, podstoupit gynekologické vyšetření lékařem nebo ultrazvukem dělohy. Můžete identifikovat choriový gonadotropin v moči, ale ne u výtoku z genitálií!
2. Rakovina dělohy a děložního čípku. K diagnostice maligní degenerace endometria je potřebný histologický materiál ve velkém množství. A vezměte ji přímo z dělohy se samostatnou diagnostickou kyretou.

Rakovina děložního hrdla a jiné patologické stavy (eroze, leukoplakie, koilocytóza, poškození HPV, atypické buňky atd.) Jsou založeny na výsledcích cytologické studie. Tato analýza se provádí přímo z děložního čípku, z transformační zóny podle specifické metody s barvením Papanicolaou (odtud název analýzy - PAP test). To se také nazývá onkocytologie.

První čtyři infekce jsou diagnostikovány PCR. A není možné zjistit přítomnost viru imunitní nedostatečnosti rozmazáním s vysokou přesností. Musíte projít krevní test.

Jak se připravit na analýzu a kdy je potřeba

Lékař užívá skvrnu od pacienta na gynekologické židli (bez ohledu na to, zda je těhotná nebo ne) pomocí speciální štětce nebo sterilní lžíce firmy Volkmann. Neublíží vůbec a velmi rychle.

Je technicky možné dosáhnout dobrého, dokonce dokonalého rozmazání, pokud si de - sanujete vagínu například chlorhexidinem nebo miramistinem. Ale jaký má smysl?

• sprcha;
• mít sex;
• používejte jakékoli produkty vaginální hygieny, intimní dezodoranty a léky, pokud nebyly předepsány lékařem;
• udělat ultrazvuku pomocí vaginální sondy;
• podstoupí kolposkopii.
• než navštívíte gynekologa nebo laboratoř, po dobu 3 hodin, neměli byste močit.

Dárcovské tahy potřebují k menstruačnímu krvácení. Dokonce i když v poslední den menstruace je jen "podráždění", je lepší odložit studii, protože výsledek bude pravděpodobně špatný - objeví se velké množství bílých krvinek.

Příjem alkoholu není zakázán.

Mohu užít antibiotikum nebo ihned po léčbě? Není to žádoucí do deseti dnů po použití lokálního účinku léků (vaginální) a jednoho měsíce po orální aplikaci antibakteriálních látek.

Předepsané mikroskopické vyšetření:

• běžně při návštěvě gynekologa;
• po přijetí do gynekologické ordinace;
• před IVF;
• během těhotenství (zejména pokud je rozmazání často špatné);
• pokud existují stížnosti: neobvyklé výboje, svědění, pánevní bolesti atd.

Interpretace výsledků: co uvažovat o normě a co - patologii v mikroflóře

Za prvé, upozorníme na tabulku, ve které jsou zobrazeny ukazatele tzv. Prvního stupně čistoty. Neexistuje zmínka o urethře v něm (ačkoli je materiál také odvozen odtud), protože mluvíme o gynekologických nemocech. Zánětlivý proces v močové trubici je léčen urologem.

Epitel - počet epiteliálních buněk se nepočítá, protože nemá žádnou diagnostickou hodnotu. Ale příliš málo epitelu mluví o atrofickém typu rozmazání - stane se to u žen během menopauzy.

Leukocyty - jsou považovány za "zorné pole":

• ne více než 10 - malé množství;
• 10-15 - mírné množství;
• 30-50 - velké množství, žena si všimne patologických příznaků a lékař během vyšetření diagnostikuje zánětlivý proces v pochvě a (nebo) na děložním čípku.

Hlen (prameny hlenu) - normálně by měl být přítomen, ale velké množství to se děje se zánětem. V močové trubici uretry by nemělo být.

Bakteriální flóra nebo laktomorfotypy - normou je ochrana vagíny před zárodky.

Trichomony, gonokoky a klíčové buňky u zdravé ženy v děložním čípku a vagině by neměly být. Kandida také chybí. Přinejmenším ve významném množství, které je zjištěno při analýze flóry.

Rozpustilost vhodnosti není velká. Ale pokud žena vstoupí do nemocnice, pak se od ní v okamžiku prvního vyšetření v křesle vzdají čerstvého.

Obvykle jsou výsledky platné 7-14 dnů. Pokud je tedy musíte před operací předat, proveďte to 3 dny před přijetím do nemocnice. Poslední z přiřazených testů.

Co se nachází v bacposseve

Gynekolog bude schopen rozluštit výsledek kulturního výzkumu nejlépe ze všech Ale ty sám, pokud čteš níže uvedené informace, zkusně zjistíš svou analýzu.

Počet mikroorganismů lze vyjádřit slovy "křížení":

• "+" Je malé množství;
• "++" je průměrná částka;
• "+++" je velké číslo;
• "++++" - bohatá flóra.

Častěji se však počet zástupců mikroflóry vyjadřuje ve stupních. Například: Klebsiella: 10 až 4 stupně. Mimochodem, je to jeden z představitelů enterobakterií. Gram negativní hůlka, aerobní mikroorganismus. Jeden z nejnebezpečnějších patogenů, i když je to jen oportovní. Je to proto, že Klebsiella je rezistentní vůči většině antibakteriálních látek.

Níže uvádíme další běžné výrazy, které se nacházejí ve výsledcích studie, nebo můžete slyšet od lékaře.

Soor - je kandida nebo jiným způsobem - drozd. Léčí se antimykotickými (antifungálními) léky.

Kvasinkovité houby blastospores a pseudomycelium - kandidóza nebo jiné houbové onemocnění, obvykle léčené podobně jako drozd.

Difteroids - podmíněně patogenní mikroorganismy, podle výsledků vědeckých výzkumů, jsou ve většině žen asi 10% mikroflóry, stejně jako streptokoky, stafylokoky, E. coli, gardnerella. Pokud je flóra narušena, jejich počet se zvyšuje.

Leptotrix je anaerobní gramnegativní bakterie, která způsobuje leptotrichózu. Přečtěte si více o tom v tomto článku.

Smíšená flóra je variantou normy, pokud nejsou žádné příznaky onemocnění, zcela leukocytů nebo jejich silné zvýšení (40-60-100). 15-20 je variantou normy, zejména během těhotenství.

Enterokoky (Enterococcus) jsou zástupci střevní mikroflóry, které se někdy dostávají do pochvy. Gram pozitivní koky. O Enterococcus fecalis (Enterococcus faecalis) jsme napsali dříve. Tam je také enterococcus coli - E. coli. Obvykle způsobují nepříjemné příznaky v koncentraci nad 10 stupňů při 4 stupních.

Pseudomonas aeruginosa je gramnegativní bakterie. Často postihuje osoby s nízkou imunitou. Má dobrou odolnost vůči antibiotikům, což komplikuje proces léčby.

Polymorfní bacil je společným představitelem vaginální biocenózy. Pokud je počet leukocytů normální a neexistují žádné stížnosti, neměla by být její přítomnost rušivá.

Erythrocyty - mohou být v malém množství v nátěru, zvláště pokud byly užívány během zánětlivého procesu nebo při malém špinění.

Kokus nebo koksobakteriální flóra - obvykle během infekčního procesu v pochvě nebo na krčku. Pokud má žena stížnosti, vyžaduje se antibakteriální léčba - vaginální debridement.

Diplokoky jsou druh bakterií (koky). V malém množství nepoškozujte. S výjimkou gonokokkov - patogeny kapavka. Ona je vždy léčena.

A nakonec budeme uvádět časté zkratky, které jsou napsány na prázdných výsledcích analýzy:

• L - leukocyty;
• Ep - epitel;
• Pl. ep. - skvamózní epitel;
• Gn (gn) -monokokus, kauzální agonista;
• Trich - trichomonas, příčinný činitel trichomoniázy.

Gramovým nátěrem

Biologie a lékařství

V závislosti na struktuře buněčné stěny jsou prokaryoty patřící k eubakteriím rozděleny do dvou velkých skupin. Bylo zjištěno, že pokud byly fixované buňky eubakterií ošetřeny nejdříve krystalovou fialou a pak jódem, vytvořil se barevný komplex. Při následné léčbě alkoholem je závislost na struktuře buněčné stěny odlišná: u takzvaných gram-pozitivních druhů je tento komplex zadržován buňkou a druhý zůstává zabarvený v gramnegativních druzích, naopak, zbarvený komplex se vymyje z buněk a změní se barvy. (Tato metoda byla poprvé navržena v roce 1884 dánským vědcem H. Gramem (Ch. Gram), který se podílel na barvení tkání. Později byl použit pro bakterie).

V některých eubakteriích je pozitivní reakce, když je barvena způsobem popsaným výše, charakteristická pouze pro buňky, které jsou ve stádiu aktivního růstu. Bylo zjištěno, že lakovaný komplex se vytváří na protoplastu, ale jeho zadržení buňkou nebo vyluhování z ní během následného zpracování alkoholem je určováno strukturními vlastnostmi buněčné stěny.

Barvení léků zvyšuje citlivost mikroskopie, protože barevné bakterie jsou špatně rozlišitelné dokonce s nárůstem 400-1000.

Diferenciální barvení Gram je nejběžnější, i když se používá i monochromatické barvení. Gramová barva umožňuje odlišit bakterie, jejichž tlustá buněčná stěna sestává téměř z peptidoglykanu (gram-pozitivní) z bakterií, jejichž buněčná stěna má navíc k tenké vrstvě peptidoglykanu vnější membránu sestávající z lipoproteinů a lipopolysacharidů (gramnegativní). Hlavní barvivo (například krystalová fialová) je pevně uchyceno ve stěně gram-pozitivních bakterií, které jim dává modročernou barvu a snadno se vypláchne alkoholem (nebo acetonem) ze stěny gramnegativních bakterií, po které jsou barveny kontrastním barvivem (např. Safraninem) červeně.

Gramové zbarvení je nepostradatelné při studiu skvrn na sputu. Pokud je sputa přijata správně, v zorném poli je pozorováno nejméně 25 neutrofilů a méně než 10 epiteliálních buněk při malém zvětšení. Vyšší počet epiteliálních buněk a různé typy bakterií naznačují, že sputa je kontaminována obsahem orofaryngu. Přestože je často obtížné rozlišit normální mikroflóru od patogenních bakterií, Gramova skvrna oděru poskytují cenné informace, pokud má patogenní bakterie k dispozici nějakou indikaci (biologický signál). Například v bakteriální vaginóze jsou epiteliální buňky dotované gram-pozitivními bakteriemi viditelné ve vaginálním nátěru.

Mikroskopie výkalů na skvrnovém skvrnu, použitá jako screeningová studie. Po zjištění neutrofilů začnou bakteriologický výzkum a stanovení toxinů produkovaných přípravkem Clostridium difficile.

Gramové skvrny se také používají k identifikaci bakterií a leukocytů v CSF, synoviálních, pleurálních a peritoneálních tekutinách. Dolní mez citlivosti metody je 10 000 bakterií na 1 ml.

Pro zvýšení citlivosti je testovaná kapalina odstředěna a připravený barevný nátěrový nátěr. Tento postup se nazývá obohacovací materiál. Je to jednoduché a obzvláště cenné pro detekci bakterií a bílých krvinek v CSF a bakteriích rezistentních na kyseliny v sputu.

Odkazy:

Metody obecné bakteriologie

Technika malování skvrn. Pro barvení nátěrů používejte nátěrové roztoky nebo inkoustový papír, jak navrhuje A.I. Modrá. Snadná příprava, snadné použití, stejně jako schopnost skladovat inkoustový papír po neomezenou dobu, byly základem jejich širokého použití při různých barvivech.

Malířský papír pro barvení. Několik kapek vody se nanáší na suchý a pevný přípravek, vloží se barevné papíry o rozměrech 2 × 2 cm. Během celého období barvení by měl papír zůstat vlhký a pevně přilne k povrchu skla. Při sušení je papír navlhčen vodou. Doba barvení skvrny je určena metodou barvení. Na konci barvení je papír pečlivě odstraněn pomocí kleští a nátěr je promyt vodovodní vodou a sušen ve vzduchu nebo filtrován.

Barvící nátěry s barvivy. Dye se aplikuje na suchý a fixovaný přípravek pipetou v takovém množství, že pokrývá celý nátěr. Když jsou nátěry barveny koncentrovanými roztoky barviv (Zielya karbolický fuchsin, karbolický horčík nebo krystalová fialová), jsou obarveny filtračním papírem, který zachovává částice barviva: páska filtračního papíru se nanáší na fixní nátěr a roztok barviva se nalije na něj.

Pro mikroskopické vyšetření jsou připravené nátěry, sušené a pevné, vystaveny barvení. Barvení je jednoduché a složité. Jednoduché zabarvení spočívá v tom, že po určité časové období použijete jednu barvu na zdvih. Nejčastěji se používá jednoduchá vodní barva pro použití alkohol-voda (1:10) Pfeiffer fuchsin, Leffler methylenová modř a safranin. Eosin, jako kyselé barvivo, se používá pouze k barvení cytoplazmy buněk ak zbarvení pozadí. Sour purpurová je zcela nevhodná pro barvení bakterií.

S jednoduchým zbarvením vnímají mikrobiální těla barvu barviva, která se používá intenzivně jako jádra buněk; současně cytoplazma a celé pozadí nátěru (pokud to není nátěr z čisté kultury) jsou natřeny ve stejné barvě, ale poněkud bledší. Fuchsin a fialová fialová jsou intenzivnější barvy; methylenová modřina má mnohem bledší barvu. Vnímání barvy závisí nejen na vlastnostech barev, ale také na vlastnostech mikrobů, které mají být zbarveny. Většina mikrobů je snadno a rychle zbarvena vodou nebo alkoholem-vodnými roztoky nátěrů.

Pro mikroskopické barvivy (například příčinu tuberkulózy) nebo jejich části (spory, flagely atd.) Je třeba použít intenzivní (nucené) metody barvení.

Barvení je možné vynutit: a) zvýšením barvivosti základních inkoustů, b) prodloužením barviv a c) působením nálevu.

Pro zvýšení barevného výkonu je barva vystavena vysoké teplotě (ohřevu), dokud se nezobrazí par (dokonce i varu). Změnou stupně ohřevu je možné získat různé stupně barvy.

Prodloužení účinků barvicího roztoku na objekt může také určitým způsobem zvýšit stupeň barvení.

Mordanty jsou látky, které usnadňují průnik barviva do buněk: fenol, tanin, kyseliny octové a chromové, alkálie apod. Mechanismus působení mořidel je jiný: v některých případech působí mořidla na barviva, v jiných na schopnost buněk vnímat barvu. Kladky působí na nátěr buď před působením nátěru (například při zbarvení vlaječky), nebo společně s nátěrem (fenol v Tsili fuchsin) nebo po působení nátěru (Lyugolevského řešení v metodě Gram).

Při malování nátěrů se kromě barev používají také tzv. Bělící nebo barvící látky. Ty slouží k odstranění přebytečné barvy z celé mikrobiální buňky nebo z její části, když je barva příliš silná při adsorbování materiálu nebo při jeho oprave pomocí tepla atd.

Jako bělící činidla se používá: alkohol, 5% vodný roztok kyseliny sírové, 20-30% vodný roztok kyseliny dusičné, 3% roztok kyseliny chlorovodíkové v absolutním alkoholu atd.

Chcete-li natřít skvrny, je nutné mít na ploše sadu barevných roztoků v lahvích (lepší než oranžové sklo) s pipetami a gumovými plechovkami. Lahvičky by měly být označeny příslušnými označeními; Aby nedošlo k rychlé kontaminaci nálepkami, doporučuje se namočit s roztaveným parafínem (pomocí kartáče). Láhve barev jsou umístěny v dřevěném stativovém bloku (obr. 2).

Obr. 2. Láhve pro barvy

Pro mytí barev a oplachů je zapotřebí láhev s trubkou na stojanu pro destilovanou vodu a formu (odtokový hrnec) se stojanem na potřísnění. Podstavec se skládá ze dvou skleněných trubek nebo tyček spojených na koncích kusy gumových trubek. Šířka stojanu by měla být menší než délka skluzu. Navíc je pro rozmazání nutný alkohol (nebo plynový) hořák a pinzety Cornet pro mikroskopické sklíčka. Při natírání s ohřevem se skleněná deska uchopí pinzetou a drží se po určitou dobu nad plamenem. V případě prodlouženého zbarvení používají kyvety nebo malé kelímky, kde nalakují barvu a ponoří je do ní. Při malování několika nátěrů v kyvetě najednou, aby se zabránilo skluzu dohromady, jsou spojeny dvěma stranami s vyloženou stranou a vyztuženy pryžovými prstenci vyříznutými z trubek. Po zbarvení se tampony promyjí vodou a důkladně vysuší filtračním papírem.

Práce posledních let odhalila možnost zachování životaschopnosti mikrobů, hlavně ložisek sporu, během barvení. Proto je nutná dostatečná fixace zdvihů. Umytou vodu (po vyfarbení) je třeba odvádět do speciální nádoby, po níž následuje neutralizace, vyčerpaný filtrační papír (po vysušení nátěrů) by neměl být likvidován, ale měl by být vypálen a použité náplasti by měly být dezinfikovány.

Jednoduché metody malování skvrn

Pomocí jednoduchého způsobu malování se několik málo kapek alkohol-voda nebo vodný nátěrový roztok nalije na pevný nátěr po dobu 1-2 minut; Pro tento účel se nejčastěji používá Fuchsin (1:10) nebo Lefflerova methylenová modř. Poté se barva odmyje destilovanou vodou a nátěr se vysuší mezi dvěma proužky filtračního papíru. Obvykle se fuchsin (1:10) zbarví 10-30 sekund a methylenová modř - 2-10 minut. Fuchsinové skvrny intenzivněji rozetří a při obarvení methylenovou modří se získávají jemnější a elegantnější přípravky. Roztok po vysušení s filtračním papírem musí být zcela suchý, jinak se zbývající vlhkost dostane do styku s cedrovým olejem, vytvoří se emulze a mikroskopie bude mít za následek obskurní obraz. Obecně trvání barvení závisí na typu a kvalitě barvicího roztoku, stupni citlivosti mikrobu na barvení a tloušťce nátěru.

Barvení Muromtsev

Připravte dvě řešení:

Kyselina karbolová (krystalická)

Po rozpuštění laku se obě roztoky promíchají a filtrují přes papírový filtr. Barva trvá dlouhou dobu. Směsy jsou natřeny pruhy filtračního papíru po dobu 15 až 30 sekund.

Při opravách skvrn autor doporučuje vyrábět směs alkoholu (80 dílů) s formalinem (20 dílů) po dobu 3-10 minut.

S touto barvou skvrn v mikrobiálních buňkách jsou detekovány inkluze, bipolarita, kapsle a spory. Metoda je vhodná pro barvení skvrn od orgánů, krve, kultur na médiích s nativním proteinem a na polokapalném agaru.

Pozadí léku z těchto substrátů je růžová; tkáňové buňky a mikrobiální těla jsou namalovány v modro-modré barvě.

Obtížné (diferenciální) metody barvení skvrny

Komplexní metody barvení jsou založeny na charakteristikách fyzikálně-chemické struktury mikrobiální buňky. Podstata těchto metod spočívá v tom, že do dvou barevných nátěrů dopadá, jeden z nich je hlavní (hlavní) nátěr a druhý - další (kontrast). Po vystavení prvnímu nátěru je nátěr změněn na barvy a teprve poté je vystaven dodatečnému zbarvení. Jako bělící činidla lze použít řadu chemických reakčních činidel (kyseliny, zásady, alkohol, aceton atd.). Umytí nátěru čistou vodou je také čistě mechanický bělící proces, ale to vyžaduje dlouhou dobu; Kromě toho je zabarvení neúplné. Ve vztahu k bělícím látkám mohou být mikroby rozděleny do skupin snadno a obtížně bělit. Ne všechny typy mikrobů jsou stejně důležité pro bělící činidla; některé jsou odolné vůči kyselinám a alkoholu, jiné jsou odolné proti kyselinám. Konečně, někteří například spóry, silně odolávají účinkům všech bělicích činidel a patří do skupiny odolných vůči barvám.

Komplexní metody barvení mají důležitou diferenciální diagnostickou hodnotu pro charakterizaci studovaného mikróbu.

Gramové skvrny

Při přípravě nátěrů (útvarů) z orgánů a tkání obsahujících mikroorganismy, hořčíku hořčíku a pak jódu má přípravek, namalovaný v černé barvě, vlastnosti bělení pod vlivem alkoholu. Současně se některé bakterie obsažené v nátěru také změní barvou, zatímco jiné se změní na fialovou. S dodatečným zbarvením (zejména s Fuchsinem od firmy Pfeiffer) jsou bakterie odbarvené alkoholem červeně barvené (gram-negativní). Jiné, které pevně udržují fialovou barvu (jód + hořčičná fialová sloučenina), které nejsou bělené alkoholem, patří do skupiny gram-pozitivních bakterií. Rozdíl mezi gram-pozitivními a gramnegativními bakteriemi závisí na rozdílu jejich izoelektrických bodů a schopnost grampozitivních bakterií zadržovat barvu je spojena s přítomností hořečnaté soli ribonukleové kyseliny, které neobsahují gramnegativní bakterie. Nejlepší ze všech je, že gramová skvrna se získává po tom, co jsou nátěry fixovány fyzikální metodou (topení). Charakteristiky postoje některých druhů bakterií k různým barvám, zejména barvení Gramovou metodou, jsou charakterizovány tzv. Tinkturními vlastnostmi mikrobů.

Technika barvení. Roztok filtrovaného papíru o nepatrné kratší velikosti a sklíčka se umístí na nátěr fixovaný teplým a na něj se nalije dostatečné množství fialového roztoku krystalického, karbolického nebo anilinového hořčíku nebo nějaká jiná fialová trifenylmethanová barva (například methylviolet) po dobu 1-2 minut. Poté se barva odčerpá, odstraní se pás filtračního papíru a bez promývání vodou se roztok Lugolu nalije na nátěr po dobu 1-2 minut. Roztok se odčerpává a odbarvuje lék v 96 ° alkoholu po dobu 30-60 sekund, promyje se vodou a zafarbí Pfeifferovým Fuchsinem (nebo ředí safraninem, neutralulem nebo vesuvinem) po dobu 2-3 minut. Poté se barva umyje vodou a nátěr se vysuší čistým filtračním papírem.

Mikroskopický obrázek: Pokud jsou gramové škvrny správně zabarveny, grampozitivní mikroby budou barevné barvy tmavě purpurové a gramnegativní barvy budou zbarveny jako další barvy (např. Růžová barva fuchsinu Fuchsin z Pfeifferu).

Nepoužívejte kontaminovaný filtrační papír: mechanický přenos mikrobů z jednoho nátěru na jiný je možný, což může ovlivnit výsledky mikroskopie. Doba trvání expozice laku, roztoku Lugolu (mordant) a alkoholu závisí na tloušťce nátěru. Zvláště důležitým bodem gramového skvrna je změna barvy nátěru alkoholem. Při krátkém vystavení alkoholu se získají překreslené přípravky a při dlouhodobé expozici se všechny mikroby (včetně p-pozitivních) změní barvou. Na tlustém, silném nátěru (například z agarové kultury) by doba expozice alkoholu měla být delší než tenká nátěr, zejména z kapalných kultur. Při vystavení alkoholu na nerovnoměrně připraveném nátěru v jeho tlustých částech zůstaly mikroby nezměněny a v tenkých barvách se změnily barvy; dostanete "pestrý" barevný vzor, ​​který může vést k nesprávným závěrům.

Někdy gramnegativní bakterie mohou být pozorovány v kultuře gram-pozitivních bakterií, která je větší, čím je starší populace. To není nic jiného než bakteriální mrtvoly, které prošly intracelulární autolýzou, v důsledku čehož buňka ztratila hořčíkové ribonuklenáty. Na druhé straně ve velmi mladých kulturách (několik hodin růstu) rodiny enterobakterií jsou gigantické mladé formy těchto bakterií, které jsou 2-3krát větší než dospělí (18hodinové), jsou velmi bazofilní kvůli tomu, že jejich cytoplazma je přetížena ribonuklenáty. Proto jsou při barvení Gramem natolik intenzivně zafarbené purpurovou barvou, že ve špatném světle mohou být považovány za gram-pozitivní vegetativní formy sporiferous tyčinky.

Pro začátečníky i v případě pochybných případů se doporučuje připravit kontrolní přípravky na stejném skle, kde se nachází zkušební nátěr - jeden z kultury mikrobů, zřejmě gram-pozitivní a druhý gram-negativní.

Pokud se barva barvy v gramově zbarveném alkoholu může nalit přímo na nátěr, neustále otřásáním skla. Je lepší provádět změnu barvy v kyvetách, kde se nalévá alkohol, a s použitím pinzety Cornetu se droga zvedá a spouští a pozoruje barvu alkoholu, který proudí ze skla. Zbarvení se považuje za úplné, když se kapky alkoholu, které tekoucí z nátěru, stávají barevněji než alkohol v kyvetě; obvykle trvá 10-30 sekund, v závislosti na tloušťce zdvihu.

Alkohol 96 ° v kyvetách by měl být vyměňován častěji (80 ° alkohol nerozlišuje správně roztírání). Vyhozený alkohol se obvykle vylije z kyvet do alkoholových hořáků.

Pro začátečníky může být doporučeno zbarvení skvrn jodovaným alkoholem. Bylo zjištěno, že pokud se k odbarvovací kapalině přidá trochu jodové tinktury, pak se mikroby, které jsou gram-pozitivně zbarveny, v této kapalině nezmění ani po dobu jedné hodiny a gramnegativní jsou zafarbené přibližně za 5 sekund. Podle Savateeva stačí přidávat 2-4 ml 10% jodové tinktury na 100 ml 95 ° alkoholu; řešení může přetrvávat po dlouhou dobu. Pokud se místo alkoholu použije aceton, před použitím se přidá tinktúra jodu.

Dvě minuty jsou dostatečné k odbarvení skvrn jodovaným alkoholem, následovaným promytím vodou a dalším zbarvením Pfeiffer-fuchsinem.

Změna metody Gramovy barvy

Jak je uvedeno výše, Gramova skvrna je nejdůležitější metodou identifikace bakterií. Teoreticky je možné rozdělit baktérie na dvě skupiny: gram-pozitivní a gramnegativní; ve skutečnosti existují případy, kdy jsou stejné bakterie charakterizovány jako "gram-selectable". Vzhledem k tomu, že metoda byla poprvé vyvinutá Christianem Gramem v roce 1884, byly publikovány četné modifikace barvy Gram. Roztok bakterií pro barvení skleněného sklíčka se získá přímou metodou z kultury na kapalném nebo pevném médiu, ale nejlépe je připravit z promytého vzorku fixovaného formalinem. Několik dalších minut strávených suspendováním bakterií v 5% (v / v) formalinu, jejich shromažďováním a promytím centrifugací se vyplácí, protože velikost a tvar buněk jsou dobře zachovány, buňky jsou rovnoměrně barveny a náhodně rozptýlené precipitáty z kapalných kultivačních médií chybí. V každém případě se doporučuje vysušit nátěr ve vzduchu a fixovat ho topením, stejně jako při jednoduchém barvení. Je důležité standardizovat metodu barvení gramem. Podobné výsledky dávají další dvě metody barvení - při modifikaci Hookera a při modifikaci Burke.

Zbarvení gramů v modifikaci Hookeru.

Roztok A pro přípravu barvicího činidla:

Křišťálově fialová (s obsahem 90% sušiny)

Ethanol 95% (obj./obj.)

Roztok B pro přípravu barvicího činidla:

Roztoky A a B se smísí, aby se získala krystalová fialová barvicí činidla. Nechte 24 hodin a před použitím filtr přes filtrační papír.

Jod a jodid draselný se rozdrtí v maltě a pomalu se přidá voda s kontinuálním mletím až do rozpuštění jodu. Uchovávejte v tmavé baňce.

Rozpouštědlo pro bělení:

Ethanol 95% (obj./obj.)

Safranin O [2,5% (hmotn./obj.) 95% (obj./obj.) Ethanol]

Vzduchově sušený, bakteriální nátěr rozmazaný v teple se ponoří po dobu 1 minuty do roztoku barvení krystalovou violetí.

Roztok se promyje 2 sekundy ve slabé, úhlové trysce z vodovodní sítě.

Roztok se umístí do jodového mordantu po dobu 1 minuty.

Je promyta slabým proudem, který proudí po dobu 2 vteřin v úhlovém proudu vody z vodovodu, po kterém se vysuší s blotu.

Ponořte nátěr po dobu 30 sekund do 95% ethanolu a protřepejte tenkrát, a poté se tento nátěr vysuší pomocí blotovacího papíru.

Ponořte nátěr po dobu 10 s do dalšího barviva.

Roztok se promyje slabým, úhlovým proudem vody z vodovodu, dokud barva v odtoku nezmizí a poté se vysuší s blotovací papír.

Gramová barva v modifikaci Burke.

Křišťálově fialová (s obsahem 90% sušiny)

Mordant připravil stejným způsobem jako pro modifikaci Hookeru.

Rozpouštědlo pro změnu barvy: (opatrně, hořlavý!)

Safranin O (s obsahem 85% sušiny)

Roztok, usušen ve vzduchu a fixován zahříváním, se ponoří do roztoku A, přidá se 2-3 kapky roztoku B a inkubuje se 2 minuty.

Utěrku opláchněte jódovým mordantem a poté jej zakryjte 2 minuty čerstvým mordant.

Tampon se omyje slabým proudem vody z kohoutku po dobu 2 sekund. Povrch kolem nátěru se vysuší pomocí blotovacího papíru, ale samotný nátěr je chráněn před vysycháním.

Rozpouštědlo s odbarvováním se aplikuje po kapkách na skvrnu se sklopným skleněným podložním sklíčkem, dokud barva nezmizí z rozpouštědla proudícího ze skla. Poté je nátěr sušen ve vzduchu.

Gramova metoda je tohle. Jaká je Gramova metoda?

Gramova metoda je metoda barvení mikroorganismů pro výzkum, který umožňuje diferenciaci bakterií podle biochemických vlastností buněčné stěny. V roce 1884 navrhl dánský lékař G. K. Gram.

Gramové baktérie obarvené anilinovými barvivy - hořčicí nebo methyl fialou apod., Pak se barvivo fixuje roztokem jódu. Během následného promytí barevného léčiva alkoholem se tyto typy bakterií, které jsou pevně zbarvené, nazývají Gram-pozitivní bakterie (označené Gram (+)), na rozdíl od gram-negativních bakterií (Gram (-)), které při omytí změní barvu.

Použití v diagnostice

Gramové skvrny mají velký význam v systematice bakterií, stejně jako v mikrobiologické diagnostice infekčních onemocnění.

Gram-pozitivní koky (s výjimkou zástupců rodu Neisseria) a sporiferous formy bakterií, stejně jako kvasnice, jsou namalovány v modro-černé (tmavě modré) barvy.

Mnoho nebulózních bakterií je gramnegativní, červené, jádra buněk jsou červeně červené a cytoplazma je růžová nebo karmínová.

Technika barvení

Gramové zbarvení se vztahuje na komplexní metodu barvení, když je rozmazání ovlivněno dvěma barvivy, z nichž jedna je hlavní a druhá je dodatečná. Kromě barviv se bělící prostředky používají pro komplexní metody barvení: alkohol, kyseliny atd.

Gramové barvení často používají anilinová barviva z trifenylmethanové skupiny: hořčice, methyl fialová nebo krystalová fialová. Gram-pozitivní Gram (+) mikroorganismy poskytují silné spojení s těmito barvivy a jódem. Současně se při expozici alkoholu neztrácejí, což vede k tomu, že při dodatečném barvení s Fuchsinem Gram (+) se mikroorganismy nemění původní purpurovou barvou.

Gram-negativní Gram (-) mikroorganismy tvoří sloučeninu se základními barvivy a jodem, který je snadno zničen působením alkoholu. Výsledkem je, že se mikroby změní barvou a poté se zbarví purpurovou červenou barvou.

Příprava materiálu pro lakování

Zkušební materiál se rozptýlí v tenké vrstvě na povrchu dobře odmaštěného šoupátka. Připravený nátěr se suší na vzduchu a fixuje se po úplném vyschnutí. Histologické řezy se připravují rutinní technikou, která fixuje kusy tkáně ve formalinu a nalije do parafínu.

Opravy

Při fixování je nátěr fixován na povrch sklíčka, a proto se během následného zafarbení přípravku neprobíhají mikrobiální buňky. Kromě toho mrtvé mikrobiální buňky skvrny lépe než živé buňky.

Existuje fyzikální metoda fixace, která je založena na vlivu vysoké teploty na mikrobiální buňku a na chemické metody, které zahrnují použití chemických látek, které způsobují koagulaci cytoplazmatických proteinů.

Metoda fyzické fixace

Skleněná skluzavka s přípravkem se zachycuje pinzetou nebo prsty pravé ruky I a II o okraje kartáčkem nahoru a s plynulým pohybem se provádí 2-3krát nad horní částí plamene hořáku. Celý fixační proces by neměl trvat déle než 2 s.

Spolehlivost fixace se ověřuje následujícím způsobem: povrch bez kůže je aplikován na zadní plochu levé ruky. Pokud je nátěr správně upevněn, sklo by mělo být horké, ale nemělo by způsobit pocit hoření (70-80 ° C).

Chemická metoda fixace

Pro upevnění tampon se použije methylalkohol, aceton, směs Nikiforov (směs ethanolu 96% a anestetika éteru v poměru 1: 1), Carnoyově kapaliny (ethanol 96% - 60% chloroform, 30% ledové kyseliny octové, 10%), alkohol (40% formalin 5 ml, ethylalkohol 96 až 95 ml). Skleněná sklíčko se sušeným nástřikem se ponoří do baňky s fixační látkou po dobu 10 až 15 minut a poté se suší na vzduchu. Rovněž se používá fixace ve dvojicích 40% formalinu po dobu několika sekund.

Smear barvení proces

1. Na pevném nátěru nalijte jednu ze základních barviv 2-3 minuty. Aby se zabránilo srážení, je znečistěno filtračním papírem.
2. Vypusťte nátěr, opatrně odstraňte filtrační papír. Roztok se nalije Lugolovým roztokem nebo roztokem jodidu podle Gramu (vodný roztok jodidu draselného a krystalického jodu v poměru 2: 1) po dobu 1-2 minut, dokud se přípravek nezčerní.
3. Roztok se vypustí, oplach se propláchne 96 ° ethanolem nebo acetonem, vylévá se a vypouští se, dokud zbarvení nezmizí a vypouštěcí kapalina je čirá (přibližně 20-40-60 sekund).
4. Pečlivě umyjte sklenici v běžné nebo destilované vodě po dobu 1-2 minut.
5. K identifikaci gramnegativní skupiny bakterií jsou přípravky dodatečně barveny fuchsinem nebo safraninem (2-5 minut).
6. Promytí se v tekoucí vodě a suší se filtračním papírem.

Technika barvení bakterií v histologických sekcích Gram-Weigert

1. Odváděné části jsou upraveny na vodu.
2. Po 20 minutách v 1% roztoku pararosanilinu nebo bazického fuchsinu v 1% kyselině octové (barvivo se zahřeje na teplotu varu, ochladí a zfiltruje).
3. Promyje se třemi posuny destilované vody.
4. Natřete 5 minut v 1% krystalové fialky v destilované vodě.
5. Rychle vypláchněte v 1% roztoku chloridu sodného.
6. Zpracovává se po dobu 30 sekund ve směsi: 1 díl jódu + 2 díly jodidu draselného + 100 dílů destilované vody.
7. Blotujte s filtračním papírem.
8. Rozlišujte, naneste na část směs stejných objemů anilinu a xylenu (1 - 2 ml); roztoky se vypouštějí, dokud se mraky barvivů nezastaví z plátku.
9. Provádí se po 3 změnách xylenu.
10. Uzavřeno v balzámu nebo v jakékoliv pryskyřici rozpuštěné v xylenu.

Výsledek: Gram-pozitivní bakterie jsou modro-černá, fialový fibrin, jádra jsou červená.

Viz též

• Barvení mikroorganismů
• Anilinové barviva

Odkazy

V němčině

• Gram, HC (1884). "U izolovat Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten". Fortschritte der Medizin 2: 185-89.

V angličtině

Metody mikrobiologického výzkumu

Účelem mikrobiologického výzkumu je stanovit etiologickou úlohu určitých mikroorganismů v případě onemocnění nebo klinického syndromu. Je třeba připomenout, že původci zánětů reprodukční systém může být jak UPM - zástupci přechodné složky normální mikroflóry pochvy a dalších přírodních stanovišť, jakož i absolutní patogenů - původci sexuálně přenosných infekcí. Taková souvislost mezi přenosnými chorobami a oportunními infekcemi (způsobenými DMP) určuje potřebu integrovaného přístupu k mikrobiologické diagnóze.

INDIKACE

Metody mikrobiologického výzkumu se používají k potvrzení nebo vyloučení onemocnění infekční povahy.

METODA

PRAVIDLA PRO KLINICKÝ MATERIÁL

Vylučování z močové trubice je prováděno s plastovou jednorázovou sterilní bakteriologickou smyčkou o objemu 1 μl nebo tenkým dakronovým tamponem na hliníkovém drátu. Předzákladní otevření močovodu by mělo být vyčištěno gázou nebo bavlněným tamponem. Při nepřítomnosti viditelných sekrecí může lékař provést lehkou masáž močové trubice. Tampon / smyčka se vloží do močové trubice o 1-2 cm a odstraní se lehkým stisknutím bočních a zadních stěn. U mikroskopických a imunofluorescenčních studií se materiál přenese na skleněnou šoupátku pomocí válcování tamponu nebo přesunu smyčky s lehkým tlakovým materiálem. Pro kultivaci a PCR se materiál umístí do zkumavek s vhodným transportním médiem.

Vnější genitálie, předvečer vagíny: šmouhy se sterilními tampony z bavlny (Dacron) z patologicky pozměněných oblastí; pro zánět velkého žláza vestibulu je provedena punkce, při otevření abscesu se žlázy hubí sterilním bavlněným tamponem.

Vagina: po vložení zrcadla a výtahu se výtok ukládá sterilním bavlněným tamponem z zadního fornixu nebo z patologicky pozměněných částí sliznice; pro účely kultivace je tampon umístěn ve sterilní trubici a okamžitě zaslán do laboratoře. Pokud tento požadavek nemůže být splněn, odebraný vzorek se umístí do zkumavky s transportním médiem.

Pro účely mikroskopie se odebraný vzorek přenese na skleněný šoupátko, navíjí se tampón na všech stranách skla a snaží se rovnoměrně rozdělit materiál, udržet přirozený vzhled všech složek biocenózy; nátěr se usuší na vzduchu, fixuje se roztokem 96% ethanolu (2-3 kapky na nátěr až do úplného odpařování), značené sklo a v uzavřeném kontejneru, který je zaslán do laboratoře. Během diagnostiky trichomoniázy v kultuře je odebraný výtok okamžitě umístěn do živného média a transportován do laboratoře.

Děložního čípku: po vystavení krční vaginální zrcátko část byla opatrně zpracuje s bavlněným tampónem namočeným v sterilním 0,9% roztoku chloridu sodného nebo vody sodného, ​​pak standardní bavlněný tampon jemně vstřikuje do kanálu děložního krčku, přičemž výtok, tampon se vyjme bez dotyku stěny vagíny, a umístěte jej do zkumavky s transportním médiem pro kultivaci. Pro provedení mikroskopie imunofluorescenční metodou v různých modifikacích, virologickém výzkumu nebo PCR, je materiál odebírán speciálním kartáčem, který je vložen do kanálu po odstranění hlenové zátky nebo odebrání vzorku pro kultivaci. Po vložení kartáče do cervikálního kanálu se několikrát otáčí o 1-2 cm, aby se dosáhlo buněčného škrabání, ale aby se zabránilo skarifikaci a krevními prvky na tamponu. Získaný materiál se umístí do zkumavek s vhodným transportním médiem. U mikroskopických a imunofluorescenčních studií se odebraný vzorek okamžitě přenese z tamponu do skleněné sklíčky.

Děloha: materiál z dělohy pro výzkum lze získat pouze pomocí speciálního zařízení s vnějším povlakem na aspirátoru stříkačky. Sledujte pravidla asepse, projděte cervikální kanál a v děloze otevřete vnější membránu injekční stříkačky a poté odsajte obsah. Potom uzavřete vnější plášť a vyjměte sondu z dělohy.

přívěsky dělohy: materiálu ze zdroje infekce lze získat pouze chirurgicky (hnis, exsudáty, biopsie) nebo při diagnostických punkcí nádorových útvarů v pánvi, prováděné přes vaginální klenby (měl zvážit možnost kontaminace vzorku vaginální mikroflóry). V některých případech, pokud místo infekce v děložních příměsích komunikuje s děloze, opakované studie cervikálního kanálu mohou být užitečné, pokud jsou výsledky studie stejného typu. Moč: po důkladném propláchnutí vnějších pohlavních orgánů se střední část volné uvolněné moči v množství 5 až 10 ml shromáždí ve sterilním obalu. Vzhledem k tomu, že mikroorganismy obsažené v moči se začínají množit při pokojové teplotě, musí se vzorka odevzdat do laboratoře během 1-2 hodin, aby se předešlo falešným výsledkům při kvantifikaci stupně bakteriurie. Pokud není možné splnit tento požadavek, je možné uchovávat vzorek moči při teplotě 4 ° C v chladničce maximálně 12 hodin.

Krevní kultivace (detekce bakteriémie) je nezbytná, pokud máte podezření na vznik syndromu systémového zánětu. Trvalá hypertermie, zimnice, hypotermie, leukocytóza, příznaky multiorgánové dysfunkce slouží jako kategorická indikace pro mikrobiologické vyšetření krve. Vzorky krve byly odebrány co nejdříve od nástupu horečky 2 až 3-krát v intervalu 30-60 minut z periferní žíly horních končetin (odběr krve v nadmořské výšce horečky nezvyšuje citlivost metody, tím důležitější se stává Optimální množství darované krve na etiologii onemocnění). Optimální použití standardních komerčních lahví s připravenými živinami pro kultivaci aerobních mikroorganismů a přísných anaerob. Zvláštní pozornost věnovaná dodržování pravidel asepse: kůže na místě venipunktury je ošetřena 1-2% roztokem jódu nebo povidonjodinu s pohyby od středu k periferii po dobu nejméně 1 minuty. Po dezinfekci je palpace místa venipunktury nepřijatelná. Bezprostředně před propíchnutím žíly se pokožka ošetří 70% roztokem ethanolu. Manipulace se provádí v sterilních rukavicích. Plastové čepice jsou vyjmuty z lahví, pryžové zátky jsou otřeny 70% roztokem ethanolu. Po odebrání krve z žíly změní jehlu a propichne gumovou zátkou, přiveze krev do lahvičky (v každé ze dvou lahviček je asi 10 ml krve). U dětí mladších 1 roku užívejte 0,5 až 1,0 ml krve v jedné láhvi. U dětí od 1 roku do 6 let je celkový odebraný objem krve 1 ml pro každý rok života a tento objem je rozdělen mezi dvě lahve. U dětí a dospělých s hmotností od 30 do 80 kg se mezi dvěma lahvičkami rozdělí 10-20 ml krve.

Užívání jednoho vzorku z periferní žíly a druhé z katétru je přípustné pouze ve výjimečných případech: v případě potřeby identifikujte bakteriemii spojenou s katétrem nebo v případě objektivních potíží spojených s vévodstvím.

MIKROSKOPICKÁ STUDIE KLINICKÝCH VZORKŮ

Důležitá fáze mikrobiologického výzkumu v diagnostice ITS a oportunních infekcí. Umožňuje, aby předběžné hodnocení kvalitativní a kvantitativní složení mikroflóry patologického ložiska, posoudit kvalitu materiálu k zachycení (odpovídající jeho místa zánětu, jako je například přítomnost vaginálního epitelu v výtěrů z cervikálního kanálu, to představuje porušení pravidel výběru biologických testů), jakož i pro identifikaci mikroorganismů nerostou na obyčejných živných médiích (gonokoky, trichomonády, přísně anaerobní bakterie).

Citlivost metody světelné mikroskopie je na úrovni detekce mikroorganismů v množství 4-5 lg CFU / ml a více. Proto v některých případech mohou být etiologicky významné mikroorganismy detekovány mikroskopií. To se především týká striktně anaerobních bakterií, obvykle s nízkopatogenními schopnostmi, jejich etiologická role se projevuje na vysoké kvantitativní úrovni po akumulaci v zdroji infekce. S ohledem na zvláštnost mnoha druhů morfologie striktně anaerobních bakterií (bakteroidyprevotelly, fuzobakterii, Mobiluncus, veylonelly, leptotrihii) a mikroaerofila gardnerelly, jejich detekce v Gram-potřísněné výboje vaginálním výtěru dokazuje jejich etiologické roli. Zásadní význam je mikroskopie vaginálních nátěrů při diagnostice bakteriální vaginózy a dalších vaginálních infekcí.

Avšak většina případných anaerobních DIM nemá morfologickou originalitu a jejich stupeň patogenity a citlivosti na antibiotika je naopak velmi rozmanitý. Proto je pro tuto skupinu nutný kulturní výzkum UPM. Také Diagnostika bakteriální, mikroskopická metoda má výhodu nad vyšetření kultivačního pro diagnostiku relativně vzácné v reprodukčním věku stavů vaginální microecology: Cytolytické vaginózy, střední forma microcenosis, vaginální epitel atrofie (poslední charakteristika menopauza věku).

Diagnóza vulvovaginální kandidóza je často možné provádět za poševní detekci vypouštěcí skvrna v obarvených nátěrů nebo nativní prvky houba pučící kvasinkové buňky, fragmenty pseudomycelia s blastospor. Detekce buněk hub v nátěrech s uvedením jejich velké množství (více než 4-5 lg cfu / ml) a nejčastěji doprovázeny těžkou leukocytů reakcí ve vaginálním stěru, a klinické projevy zánětu pochvy, postačí k potvrzení klinické diagnózy vaginální kandidózy.

Na laboratorní diagnostika kapavky je primárně provádí stěr odebrán z močové trubice a děložního hrdla (pokud neexistuje žádný jiný důkaz pro vyšetření loci: hltanu, spojivka, konečník). Měli byste se pokusit udělat paralelně pro 2 údery z každého lokusu pro barvení modré a Gram. Pro akutní kapavky vyznačuje nepřítomností nebo mizivou počtu zástupců normální mikroflóry laktobacilů (), velký počet neutrofilních leukocytů a přítomnosti gramnegativních diplokoků umístěnou v leukocytech (fenomén nedokončený fagocytózy) a bez leukocytů. Chronická kapavka je charakterizována přítomností různorodé mikroflóry spolu s gramnegativními diplokoky uvnitř i vně leukocytů a velkým počtem neutrofilů. Nejčastěji se diagnostika kapavky může provést na základě mikroskopie gramových skvrn. Nicméně, těhotných žen, mladistvých a dětí rozhodně kulturologie s druhovou identifikaci Neisseria gonorrhoeae odlišit od non-patogenní Neisseria, který rozpozná složky normální vaginální mikroflóry u dívek, a v případě odběru materiálu z nosohltanu měli být vědomi velkého počtu druhů non-patogenní Neisseria v těchto nátěrech v kterémkoli věku

Mikroskopická metoda zůstává v současnosti hlavní v diagnostice urogenitální trichomoniázy. Proveďte studii nativní drogy a / nebo barevného nátěru. Mikroskopie nativní drogy, je důležité si uvědomit, že je třeba vyšetřit čerstvě materiál (oddělitelnou urethru, vagínu) - v přípravě odhalují živé, mobilní Trichomonas. Pro tento přípravek se připraví podle metody popsané v „drcených“ kapiček (vybíjecích pořízených s přidáním teplé, v blízkosti tělesné teploty 0,9% roztokem chloridu sodného se překryje krycím sklem), nebo „visí“ kapka (vyloučení přijaté od sraženiny byl umístěn do jamky sklíčko) a mikroskopiruyut při zvětšení 400 krát, když je kondenzátor spuštěn. Přípravky pro barvení methylenovou modří, Gram nebo Romanovsky - Giemsa jsou připraveny z tohoto materiálu. Diagnóza je založena na identifikaci typických forem Trichomonas vaginalis v roztocích.

Při hodnocení výsledků mikroskopie vaginálního skvrna je třeba věnovat pozornost následujícím skutečnostem:

• stav vaginálního epitelu: převládající buňkami povrchu, střední nebo parabazální vrstvou; přítomnost takzvaných „jádrových“ buňky - povrch epiteliálních buněk, hustě adherentní k nim gramvariabelnymi malé tyčinky, skrývá hranice buňky, či „lozhnoklyuchevyh“ buňky (Obrázek 6-1.) - Zvýšená přilnavost k epiteliálním buňkám grampozitivních tyčí, obvykle laktobacilů ( Obr. 6-2);
• leukocytární reakce: její přítomnost, závažnost, projevy fagocytózy, její dokončení;
• složení mikroflóry: kvantitativní a kvalitativní posouzení morfotypů a tinkturálních vlastností.

Obr. 6-1. Falešné klíčové buňky (mikroskopie gramů).

Obr. 6-2. Normotsenosis (mikroskopie Gram smear). Hodnocení celkové mikrobiální kontaminace se provádí na 4bodovém systému (Nugentova kritéria, poněkud modifikovaná) - počtem mikrobiálních buněk zjištěných ve stejném zorném poli během mikroskopie s ponořením:

+ - až 10 mikrobiálních buněk v zorném poli - minimální počet; ++ - z 11 až 100 mikrobiálních buněk v zorném poli - průměrné číslo; +++ - ze 100 až 1000 mikrobiálních buněk v zorném poli - velké množství;

++++ - více než 1000 mikrobiálních buněk v zorném poli - masivní množství.

Kvalitativní hodnocení vaginální mikroflóry zahrnuje diferenciaci všech morfotypů podle jejich tinkturálních vlastností a morfologických vlastností. Rozlišovat morfotypy laktobacilů fuzobakterii, Bacteroides, Mobiluncus, leptotrihy, veylonell, gardnerellas, stejně jako gram-pozitivní koky, koliformní hole kvasinky. Trichomonas a další parazity se nacházejí v nátěru.

Pokud je podezření na syfilis, mikroskopie tmavého pole odnímatelných eroze a vředů a způsob přímého imunofluorescenčního vyšetření pomocí diagnostiky AT na T. pallidum neztratili svou diagnostickou hodnotu. Tyto metody se používají v případech s klinickými projevy na kůži a sliznicích podezřelých ze syfilisu. Kromě toho mohou být přípravky pro mikroskopii připraveny z bodových regionálních lymfatických uzlin, cerebrospinální tekutiny, plodové vody. Erozivnoyazvennuyu povrch jemně (tak, aby příjem krvácení) se čistil za použití tamponem zvlhčené 0,9% roztoku chloridu sodného, ​​pak se opatrně otevírat a zavírat dva prsty základní vředy / eroze, stimulují sekreci serózní tekutiny, která bere v bakteriologické smyčky nebo jemně, vztahujících se erozivní povrch skleněného sklíčka. Výsledný serózní výtok je smíchán s rovným množstvím 0,9% roztoku chloridu sodného, ​​pokrytého krycím sklem a přirozený přípravek je mikroskopován, aby detekoval patogen pro řadu charakteristických morfologických znaků a typů pohybů. Jsou vyžadovány určité zkušenosti, aby se v mikroskopii rozlišoval bledý treponém z poměrů treponem urogenitálního traktu.

Více objektivní může být diagnóza mikroskopických přípravků s použitím přímé imunofluorescence. V těchto případech je výtok ze skleněných sklíček z jakýchkoli tkáňových tekutin, povrchy patologických oblastí (včetně materiálu pitvy) sušen ve vzduchu, fixován ethanolem nebo methanolem. Poté se na přípravek aplikuje anti-treponemální globulin specifický pro T. pallidum. Mikroskopické vyšetření činidla je detekováno jasně zeleným specifickým fluorescencím.

Imunoluminiscenční metoda - hlavní a laboratorní diagnostika HG, zatímco při přípravě patologického materiálu je detekován virus Ag. Obvykle se používá metoda přímé imunofluorescence, která umožňuje oddělené stanovení obou typů HSV a sérotypů HSV1 a HSV2. Citlivost a specificita metody závisí na kvalitě používaných diagnostických sestav. Materiálem pro studium je obvykle tekutina z otevřených váčků, vypouštění erozivních povrchů kůže a sliznic nebo škrábání ze stěn cervikálního kanálu (s latentní formou infekce). Materiál se odebere bakteriologickou smyčkou nebo speciálním tamponem a přenese se na skleněnou sklíčko.

V urogenitálních chlamydiích je detekcí Ar chlamydií za použití imunofluorescenční mikroskopie jednou z předních laboratorních diagnostických metod. Obvykle se používá přímá imunofluorescence, při které se monoklonální protilátky aplikují na různé Chlamydia Ag - lipopolysacharidy (skupina), hlavní proteinové druhy vnějších membrán Chlamydia a protilátky proti rekombinantnímu Ag chlamydiím. Kvalita diagnostiky určuje stupeň citlivosti metody. Velký význam při hodnocení kvality přímé imunofluorescence odebírání materiálu má: skvrna na skleněné vzorku odebraném z děložního čípku, musí být přítomen válcové epiteliálních buněk a chybějící skvamózní epiteliální buňky, erytrocytů a leukocytů. Výsledek je považován za pozitivní, jestliže na skvrnách odnímatelného mikroskopu s fluorescenčním mikroskopem na oranžovo-hnědém pozadí epiteliálních buněk najdeme nejméně 5 elementárních těles se 100násobným zvýšením. Z důvodu možných falešně pozitivních výsledků se tato metoda nedoporučuje pro studium materiálů odvozených z nosohltanu a konečníku.

KULTURNÍ VÝZKUM

Způsob výsadby a izolace čistých kultur patogenů choroby slouží jako "zlatý standard" mikrobiologické diagnostiky. Spolu s mikroskopií je kulturní výzkum hlavní metodou pro diagnostiku kapavky, trichomoniázy, chlamydií. Metody molekulárního a biologického výzkumu nejsou dosud dostatečně specifické, aby detekovaly tyto patogeny STI k nahrazení klasických metod, ale nepochybně k nim patří i budoucnost. Jinak vznikla situace s oportunními infekcemi genitálního traktu, jejichž počet se v éře antibiotik a urbanizace života společnosti neustále zvyšuje, jejich etiologická struktura a citlivost na antibiotika se dynamicky mění. Častá antibiotická rezistence těchto mikroorganismů způsobuje selhání léčby, a proto je v moderních podmínkách považován za neustálý klinický problém odpovídající výběr racionální etiotropní terapie.

Je známo, že příčinnými činiteli zánětlivých procesů pohlavních orgánů mohou být různé UPM, které jsou obvykle součástí přechodné složky původní (normální) mikroflóry vaginy a sousedních biotopů. Jejich patogenní vlastnosti se projevují pouze za určitých podmínek, poruch imunitní homeostázy makroorganismu a lokální kolonizační rezistence. Za těchto podmínek by měla mikrobiologická diagnostika zohlednit možnou etiologickou úlohu širokého spektra patogenů a nikoliv pouze jakéhokoliv specifického patogenu, jako v diagnostice klasických infekčních onemocnění způsobených absolutními patogeny. Úkolem studie je nejen identifikace mikroorganismů nalezených v patologickém materiálu, ale i zdůvodnění jejich etiologické role v zánětlivém procesu u tohoto pacienta. Při výsevu klinického materiálu, zejména z lokusů a normálně s mikroflórou, je proto velmi důležité použít nejrozmanitější živné prostředí, které je vhodné pro kultivaci široké škály mikroorganismů. V tomto případě je nutné vzít v úvahu kvantitativní poměry růstu různých typů mikroorganismů v primárním semenech, jelikož pravý příčinný faktor nejčastěji hraje dominantní roli mezi spolupracovníky. Existují však druhy, které vykazují malé množství patogenních vlastností (streptokoky skupin A a B, proteus, Klebsiella, Staphylococcus aureus, Listeria atd.).

Mikrobiologická diagnostika oportunních infekcí pochvy je založena na integrovaném hodnocení výsledků mikroskopických a kulturních studií. Přísně anaerobní složka mikroflóry je hodnocena mikroskopií gramů - velké množství anaerobních morfotypů zjištěných světelnou mikroskopií (jejich počet v oddělitelné vagině přesahuje 6 lg CFU / ml) naznačuje jejich etiologickou roli. Současně není stanovení citlivosti anaerobů na antibiotika v současné době klinicky účelné, protože převážná většina z nich je vysoce citlivá na antibiotika s anaerobní aktivitou (klindamycin, metronidazol).

Naopak u fakultativních aerobních a aerobních mikroorganismů je významně snížena diagnostická hodnota mikroskopického vyšetření vaginálního výboje. To je zapříčiněno zaprvé skutečností, že patogenní schopnosti těchto bakterií se mohou projevit na poměrně malém množství (3-5 lg CFU / ml), které není mikroskopicky detekováno. Za druhé, i když se morfotypy fakultních anaerobních bakterií nacházejí v gramech, jsou morfologicky stejné u mnoha druhů a rodů bakterií (jde o koliformní tyčinky nebo grampozitivní koky). Současně mohou být jejich patogenní vlastnosti a citlivost na antibiotika velmi rozmanité. Proto je pro popisné části fakultativnoanaerobnoy microcenosis a mikroaerofilních (především laktobacily), které mohou být podobné morfologie s mnoha typy bakterií obligatnoanaerobnyh (. Clostridia, eubakterie, Propionibacterium a kol), je nezbytné, kultury - secí poševní výtok. Pro tyto účely se používá 5% krevního agaru (nejvíce univerzální médium pro většinu UPM), agaru Saburo (pro izolaci hub), MPC média (pro kultivaci laktobacilů).

Výsledky studie o kultuře poskytují příležitost k posouzení druhového složení a kvantitativního poměru různých druhů v souvislosti s mikroorganismy, včetně hub a také laktobacilů, a tím potvrzují, že laktomorfotypy, které byly detekovány gramaticky mikroskopicky, patří do rodu laktobacilů. Izolace z patologického materiálu a identifikaci jednotlivých druhů čeledi Enterobacteriaceae, stafylokoků, streptokoků, nefermentujících bakterií, Neisseria, koryneformní bakterie, houby a jiné mikroorganismy po kvantifikace jejich růst určit míru jejich etiologické významu v rozvoji vaginitidy v konkrétním pacientovi.

Navíc v případech, kdy je diagnóza bakteriální vaginózy prováděna mikroskopií gramnegativního nátěru, mohou výsledky očkování odhalit zvýšené titry UPM (houby, enterokoky, koliformní bakterie a jiné bakterie), které mohou způsobit komplikace po etiotropní terapii s anaerobní aktivitou. Zejména je třeba mít na paměti mikroorganismy, které jsou i v nízkých koncentracích faktorem zvýšeného rizika plodu (Listeria, Streptococcus skupiny A a B).

Metody identifikace nukleových kyselin

Metody detekce DNA a RNA patogenů se v současnosti používají hlavně pro diagnostiku virových infekcí. Metody génové diagnostiky jsou založeny na identifikaci nukleotidových sekvencí přímo v patologickém materiálu pomocí molekulárních sond - uměle odvozených nukleových kyselin doplňujících se k virovým nukleovým kyselinám a značených biotinem nebo radioaktivním štítkem.

Vlastností metody PCR je opakované kopírování (amplifikace, replikace) za použití enzymu DNA polymerázy specifického fragmentu DNA sestávajícího z několika desítek nebo stovek nukleotidových párů, který je jedinečný, tj. Specifický pro tento typ virového patogenu. Mechanismus replikace je takový, že dokončení fragmentu může začít pouze v určitých počátečních blocích, pro jejichž vytvoření v daných oblastech DNA se používají primery - speciálně syntetizované oligonukleotidy. Primery jsou komplementární k sekvencím uvnitř hranic specifického fragmentu a syntéza DNA probíhá pouze v rámci těchto hranic.

Způsob PCR spočívá ve velkém počtu cyklů syntézy (amplifikace) specifického fragmentu DNA, akumulaci velkého počtu kopií, které pak lze detekovat běžnými metodami detekce (imunofluorescenční analýza, elektroforéza).

● jednoduchost provedení, ● možnost úplné automatizace, ● rychlost dosažení výsledku, ● malé množství patologického materiálu potřebného pro výzkum, ● možnost diagnostiky akutních, chronických, latentních infekcí;

● identifikace nepolatelných, perzistentních patogenů.

Citlivost PCR je nejdokonalejší jako diagnostická metoda (několik řádů vyšší než jiné testy). Specifičnost metody je také vysoká, ale zatím většina testovacích systémů není dostatečně spolehlivá, aby vynucovala klasické metody diagnostiky i absolutních patogenů.

Pokud jde o oportunní infekce, význam molekulárně genetických diagnostických metod ještě nelze považovat za smysluplný, protože rozhodujícím faktorem při vývoji takových zánětlivých procesů je kvantitativní faktor a nikoli přítomnost samotného mikroorganismu v zkoumaném místě.

V současné době se metody PCR široce používají při diagnostice virových, parazitárních a bakteriálních infekcí, často jako primární screening, stejně jako při kontrole léčení v kombinaci s jinými metodami laboratorní diagnostiky. Pomocí nejnovějších technologií, jako je PCR v reálném čase a NASBA, je možné stanovit přesné množství viru u pacientů s HIV.

SEROLOGICKÉ DIAGNOSTICKÉ METODY

Metody, které identifikují specifické AT a Ar patogeny. Jejich úloha je důležitá zejména v případech, kdy izolace patogenu představuje významné potíže. Pokud je detekována specifická AT, je nutné stanovit zvýšení jejich titrů, v souvislosti s níž jsou sdružená séra studována s intervalem 2-3 týdnů. Definice tříd imunoglobulinů jasně popisuje fáze infekčního procesu a v některých případech může sloužit jako prognostický znak jejího průběhu.

Velmi důležité jsou metody detekce Ag patogenů. Mohou být detekovány již v nejranějších stádiích infekčního procesu, což umožňuje expresní diagnózu a kvantitativní stanovení Ar v dynamice nemoci slouží jako kritérium účinnosti léčby.

Pro diagnostiku syfilisů a infekce HIV se staly sérologickými metodami zásadní význam. Při diagnóze infekce HIV se obvykle používá enzymatický imunosorbentní test, který umožňuje dosáhnout pozitivních výsledků studie již 1-1,5 měsíců po infekci. Pozitivní výsledky screeningu pomocí enzymového imunoanalýzy vyžadují potvrzení imunoblotovou metodou, která umožňuje ověření protilátek proti různým virovým proteinům.

V diagnostice syfilisu se v současné době používá řada sérologických metod, které umožňují detekovat protilátky proti různým determinantům AH T. pallidum v těle. V závislosti na použitém Ag jsou serologické reakce rozděleny do dvou skupin: treponemální a non-treponemální. První je použita pro screening. Jsou technicky jednoduché, nevyžadují hodně času, kvantitativní verze reakce s určením titru AT je možná, což jim umožňuje použít k posouzení účinnosti léčby. Tyto testy však nezaznamenávají AT v prvních 2-4 týdnech primární syfilis a jsou možné falešně pozitivní a falešně negativní reakce.

Treponemální testy mají vysokou specifičnost a umožňují potvrdit výsledky testů, které nejsou prováděny treponemem. Treponemální testy však byly nespolehlivé ve studii mozkomíšního moku (s výjimkou reakce přímé hemaglutinace), ale také nejsou používány jako kontrola účinnosti léčby a není vyloučena možnost falešně pozitivních reakcí.

Při příležitostných bakteriálních infekcích, jejichž původci mají mnoho společných argentin s argulární Ag hostitele a které slouží jako slabé stimulátory pro produkci specifických protilátek, se prakticky nepoužívají serologické diagnostické metody.

INTERPRETACE VÝSLEDKŮ MIKROBIOLOGICKÉHO VÝZKUMU

HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ MIKROBIOLOGICKÝCH VÝZKUMU ZVÝŠENÝCH ŽENOVÝCH GENITÁLNÍCH ORGÁNŮ

Při posuzování výsledků mikrobiologických studií oddělené mrzačení ženských pohlavních orgánů je třeba považovat za soubor atributů v každém případě: údajů mikroskopie primární stěr zkušební materiál, výsledky přímého výsevu na pevných živných půdách (kvantitativní odhad růstu různých typů), stejně jako klinické příznaky choroby a historii pacienta. Tak, při vyšetřování materiálu uzavřených dutin (tečkované nádorových formací v pánvi, plodové vody), jakož i ústrojí, obvykle sterilní (děloha obsah škrábání endometria kousky orgánů a tkání odstraněny v průběhu chirurgického zákroku), růstu mikroorganismů, zejména v monokultuře, důkaz jejich etiologické role. Při studiu materiálu z lokusů a normálně s různou mikroflórou je velmi důležité při hodnocení druhového složení, kvantifikaci růstu různých druhů pěstovaných při primárním osevu, jednotnosti výsledků s opakovanými studiemi a také klinických údajů. Na základě integrovaného posouzení výsledků mikroskopie a kultury vypouštění vaginy lze navrhnout následující mikrobiologické kritéria pro hodnocení stavu vaginální mikrokenózy pro jednotlivé nosologické formy u žen v reprodukčním věku.

NORMOCENOZA

• Mikroskopické stěr, Gram barveny (obr. 6-3): ♦ vaginální epitel obsahuje buňky povrchové vrstvy, mezivrstva je méně časté buněk (poměr se může lišit v závislosti na fázi menstruačního cyklu, v těhotenství, mnoho mezilehlých buňky), „klíč“ buňky postrádající někdy setkat „lozhnoklyuchevye“ buňky; ♦ leukocytů reakce je nepřítomné nebo špatně exprimován - jednotlivé leukocytů v zorném poli, ♦ celkový počet mikroorganismů mírných nebo velké, ♦ dominantní morphotype - laktobacily další mo typy jsou buď chybějící nebo jejich počet je vypočten

jediné mikrobiální buňky ve vzácných zorných polohách.